免疫沉淀实验是生物医学领域中研究蛋白质相互作用及表达状态的重要技术。根据具体实验需求，可以选择不同的免疫沉淀方法，主要包括磁珠免疫沉淀法与固定免疫沉淀法。

磁珠免疫沉淀法利用蛋白A或蛋白G磁珠与特定抗体结合，能够高效捕获目标蛋白。该方法具有操作简单、快速和分离效率高的特点，尤其适用于高通量筛选与自动化实验。通过磁性分离架，磁珠可以快速分离，使实验步骤更加简便。此外，磁珠免疫沉淀法对于研究蛋白质之间的相互作用和信号传导通路极为有效。

与此不同，固定免疫沉淀法通过固定化抗体（通常是与珠子偶联的抗体）来捕获目标蛋白，通常用于蛋白质印迹法（Western Blot）分析前的样品准备。虽然该方法需要较长的孵育时间来形成免疫复合物，但其能提供高特异性和灵敏度的结果，适合用以定量分析目标蛋白的表达与修饰状态。在研究蛋白质表达水平、翻译后修饰及稳定性方面，固定免疫沉淀法表现尤为重要。

在之前的内容中，我们已介绍了磁珠免疫沉淀法的具体操作，以下将对固定免疫沉淀法的实验操作进行详细描述。

所需溶液与试剂

(1) PBS缓冲液。
(2) 1×细胞裂解缓冲液：20mM Tris（pH 7.5）、150mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、25mM 焦磷酸钠、1mM β-甘油磷酸酯、1mM Na3VO4、1µg/ml 亮抑酶肽。
(3) 3×SDS样品缓冲液：187.5mM Tris-HCl（pH 6.8，25°C），6% w/v SDS，30% 甘油，150mM DTT，0.03% w/v 溴酚蓝。

注：以上溶液均用超纯水制备。细胞裂解液在使用前需添加1mM PMSF。

1. 制备细胞裂解物

(1) 吸干培养基，根据实验目的，添加含有调节因子的鲜培养基，对细胞处理一段时间。
(2) 去除培养基后，用冰冷的PBS洗涤细胞一次。
(3) 去除PBS，每块细胞培养板（10 cm）添加0.5 ml 预冷的1×细胞裂解缓冲液和1mM PMSF。
(4) 在冰上孵育5分钟。
(5) 从板上轻轻刮下细胞，转移至微量离心管，置于冰上。
(6) 在冰上对样品超声处理四次，每次5秒。
(7) 在4°C下微量离心10分钟，然后将上清液转移到新的试管中。
(8) 尽快进行下一步操作，如需暂时存放，裂解物可保存在-80°C。

2. 免疫沉淀法

(1) 取200μl细胞裂解物，并添加10µl固定抗体，置于摇床轻轻摇动，在4°C下孵育过夜。
(2) 在4°C条件下微量离心30秒。
(3) 用500µl的1×细胞裂解缓冲液重悬沉淀物进行清洗，然后离心去除上清，总共清洗五次。洗涤期间，保持样品在冰上。
(4) 使用20μl 3×SDS样品缓冲液重悬沉淀物，涡旋混匀后再微量离心30秒。
(5) 加热样品至95-100°C，并持续2-5分钟。
(6) 取15-30µl样品上样于SDS-PAGE凝胶，开展蛋白质印迹实验（详见蛋白质免疫印迹法实验步骤）。

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