细胞冻存是通过将细胞置于低温环境中，以减少细胞代谢，达到长期保存和保种的目的，从而可用于后续的实验或临床应用。细胞冻存通常采用慢冻原则，这样可以使细胞逐步脱水，避免因大冰晶的生成而对细胞造成损害。

原理

当温度降至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎完全停止。低于-130℃时，细胞可达到最佳存活率。液氮在此过程中能够实现细胞的长期保存。冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能够迅速透过细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时提高细胞膜的通透性，增加细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，达到保护细胞的效果。

贴壁细胞冻存操作步骤

1. 预热冻存液。
2. 使用PBS冲洗细胞，加入胰酶进行消化（此步骤与细胞传代操作相同）。
3. 终止消化后，重悬细胞，并转移至无菌EP管，1000rpm下离心5分钟。
4. 弃去上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存的最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，通常不低于5×10^5/ml。
5. 完成分装后，拧紧冻存管盖并做好标记。
6. 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜。
7. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

悬浮细胞冻存操作步骤

1. 用移液管将细胞悬液吹吸均匀，并将细胞悬液移入离心管。
2. 1000rpm离心3分钟，收集细胞沉淀。
3. 用预热的冻存液重悬细胞，细胞冻存的最佳密度为3-5×10^6/ml，通常不低于5×10^5/ml。
4. 完成分装后，拧紧冻存管盖并做好标记。
5. 将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜。
6. 将冻存管转移至液氮进行长期保存。

注意事项

1. 细胞培养、传代以及冻存需严格遵循无菌操作。
2. 传代需适度消化，消化时间受到消化液类型、配制时间及加入培养瓶中量等多因素影响，消化过程中应注意细胞形态变化，一旦出现胞质回缩、连接松散或成片浮起现象时应立即终止消化。
3. 传代应在细胞处于对数期且未达到汇合状态时进行。
4. 细胞冻存液需提前配制，不能直接将DMSO加入细胞悬液中。
5. 建议选择汇合度为80%-90%、活力达90%以上且处于对数生长期的细胞进行冻存操作，确保细胞状态最佳。冻存密度可根据细胞特性进行调整。
6. 程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂应提前复温至室温备用。
7. 冻存前需特别注意，避免消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以防细胞受损。
8. 冻存管盖须拧紧，避免水浴复苏时水分渗入造成污染。
9. 细胞不可在-80℃冰箱中长期保存，放置时间不宜超过3天。
10. 若液氮或冰箱距离细胞房较远，需将细胞放在干冰或冰盒中运输至细胞房。

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