IPS诱导肠类器官培养分为三个阶段：人多能干细胞培养、内胚层分化及中/后肠模式诱导以及类器官培养。本文重点讨论第三阶段——类器官培养（14-28天）。

原代操作的准备工作包括使用人正常肠类器官培养试剂盒、低因子无酚红基质胶、离心管、数个EP管、24孔细胞培养板及金属冰盒等试剂耗材。具体组分如下：

• 类器官培养基 A：100ml
• 类器官原代培养缓冲液 B：250ml
• 原代组织消化液 C：30ml
• 类器官传代消化液 D：30ml
• 组织保存液 E：100ml
• 类器官冻存液 F：20ml
• 类器官传代培养缓冲液 G：250ml

以下为具体操作流程：

一、加胶-点板-加液

1. 准备工作：

• 基质胶需在4℃冰箱中融化过夜；
• 枪头、离心管需在-20℃预冷至少半小时；
• 融化后的基质胶应在4℃保存，建议两周内使用完毕。

2. 接种要求：使用24孔板，每孔添加25μl基质胶球状体混合物及500-750μl类器官培养基。

3. 建议密度：基质胶总体积与球状体总体积的比值为25:1，球状体数量可参照500个细胞团/25μl基质胶进行接种。

4. 加胶和点板过程应在金属冰盒或冰上进行，整个操作控制在半分钟内，以保持基质胶良好的流动性。

5. 完成点板后，将培养板放入37℃培养箱内，胶化约40-60分钟，然后添加500-750μl类器官培养基 A 进行培养，约10-14天后大部分类器官的直径可达200-500μm，准备传代操作。

二、传代操作

1. 类器官数量较多或体积较大的情况下，首先要收集及洗涤类器官，确保去除基质胶。

2. 用类器官传代培养缓冲液 G 洗涤，经过冷却和离心后，保留类器官沉淀，确保其分层正常。

3. 添加类器官传代消化液 D 进行消化，严格控制消化时间，不可将细胞消化为单细胞，以确保类器官的存活率。

4. 最后，再次进行基质胶的加胶、点板和加液操作，与初次培养过程相同。

三、类器官冻存

类器官冻存需在其指数增长期进行，通常建议在传代后的第3至第4天进行。收集类器官后，轻柔洗涤，加入适量的类器官冻存液 F，进行重悬。

建议采用梯度冻存法，将冻存管放入梯度冻存盒中保存至-80℃过夜，第二天转移至液氮罐，用于长期保存。

四、复苏操作

在细胞实验前，需将水浴锅预热至37℃，在超净工作台上准备消毒的离心管及培养板。

迅速从液氮罐取出冻存管并解冻后，移入离心管，并添加比例为10:1的类器官传代培养缓冲液 G，轻柔重悬。

最后，按照之前提到的加胶、点板及加液步骤进行复苏培养。通常在10-14天内能够观察到类器官的快速生长，直径在200-500μm时可再次传代。

在整个过程中，确保操作的无菌性以及生长因子的活性至关重要。遵循这些操作细节，可以高效生成功能性人类肠道类器官，以应用于疾病建模及药物筛选研究，展现出鸿运国际品牌在生物医疗领域的卓越表现。

如有实验疑问，欢迎大家与我共同交流！

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